Evaluation of the adjuvants effect on the immunoglobulin class switching in generation of monoclonal antibodies against Paenibacillus larvae

Article information

J. Prev. Vet. Med. 2019;43(1):26-30
Publication date ( electronic ) : 2019 March 31
doi : https://doi.org/10.13041/jpvm.2019.43.1.26
1College of Veterinary Medicine and Veterinary Medical Research Institute, Jeju National University, Jeju 63243, Republic of Korea
2Vaccine Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 20892, USA
3Department of equine industry, Korea National College of Agriculture and Fisheries, Jeonju 54874, Republic of Korea
Corresponding Author. Yoon-Kyu Lim, Tel: +82-64-754-3367, Fax: +82-64-756-3354, E-mail: yklim@jejunu.ac.kr
received : 2018 December 2, rev-recd : 2019 January 22, accepted : 2019 February 15.

Abstract

American foulbrood (AFB) is caused by the bacterium Paenibacillus larvae, which is highly contagious and often lethal to honeybee broods. To control AFB, rapid diagnostic tools including those based on immunological methods are required. We produced several specific mouse monoclonal antibodies (MAbs) against P. larvae. Interestingly, a few of the MAbs were revealed to be an IgM-type antibody. To ascertain the effects of adjuvants on immunoglobulin isotype switching, BALB/c mice were immunized with various adjuvants, i.e., Freund's adjuvant (FA), Alum adjuvant, and AddaVax followed by the generation of hybridoma that secreted monoclonal antibodies to P. larvae. In the case of AddaVax, all screened hybridoma clones secreted IgG-type MAbs, whereas hybridomas generated by Alum and FA secreted 91.25% (7/80) and 66.67% (11/33) respectively, IgG-type MAbs. Although the mechanism of incomplete immunoglobulin isotype switching associated with the P. larvae antigen needs further study, our results indicate that the applied adjuvants can have a significant effect on immunoglobulin isotype switching results.

서 론

미국부저병(American foul brood, AFB)은 Paenibacillus larvae(P. larvae)의 감염에 의한 꿀벌의 치명적인 질병으로서 유충에 감염하여 유충을 썩게 만드는 것이 특징이다 [5]. 미국부저병은 빠른 감염속도와 높은 치사율을 보이므로 [3] 질병의 제어를 위해서는 신속하고 정확한 진단이 필요하며 면역학적 진단법은 이러한 목적에 부합한다 [7].

면역학적 진단법의 개발을 위해서는 병원체에 특이적인 항체가 요구된다. 이를 위하여 선행 연구에서는 [8] 세포융합기법을 통하여 P. larvae균체 항원에 특이적인 단클론항체(monoclonal antibodies, MAbs)를 분비하는 잡종세포(hybridoma)들을 얻어낸바 있다. 흥미롭게도, 이때 확립된 잡종세포들에서 모두 IgM type의 단클론항체가 분비되었다. 일반적으로 과면역시켜 활성화된 B cell에서는 초기항체 IgM을 발현시키는 IgM+ B cell에서 IgG+ B cell로의 Immunoglobulin isotype switching [15]이 일어나는 것에 비추어보면 이는 이례적인 현상이었다.

한편, ELISA 혹은 Immunochromatography법 등에 적용할 면역학적 진단소재로서는 avidity의 관점이나 [16] 순수분리의 편리성 관점에서 [12] isotype switching 완료된 IgG type의 항체가 유리한 점이 많다. 본 연구는 P. larvae에 특이적인 IgG type의 단클론항체를 분비하는 잡종세포를 수립하기 위하여 수행되었다.

Isotype switching을 위해서는 강한 면역자극이 필요하며, 면역보강제(adjuvant)를 이용하여 더욱 강한 항원자극을 일으킬 필요가 있다. 항원 면역시 함께 사용되는 adjuvant들은 각기 그 형태와 작용기전, 면역유도 효과가 다양한 것으로 알려져 있는바 [13], 비록 선행연구에서처럼 P. larvae 항원을 Freund’s adjuvant로 면역시켰을 때 IgM type의 단클론항체들이 작성되었으나, 다양한 adjuvant의 적용을 통하여 isotype switching이 완료된 단클론항체를 작출할 수 있을 것으로 사료되었다.

이를 확인하기 위하여, 본 연구에서는 3종의 adjuvant 즉, Water in Oil의 형태의 Freund’s adjuvant(FA), 금속염인 Alum adjuvant 및 Oil in water 형태인 AddaVax(adjuvant MF59 like squalene adjuvant) [2]를 사용하여 P. larvae의 항원을 BALB/c mouse에 면역시켜 잡종세포 clone을 유도하고 각 잡종세포가 분비하는 특이 단클론항체의 isotype을 비교하여 보았다.

재료 및 방법

P. larvae 면역원

P. larvae 종균(ATCC9545)을 Brain Heart Infusion(BHI) 배지에 접종하여 37℃에 24시간 배양한 후 수확하였다. 균체는 원심분리(3,735xg, 15분, 3회)하여 PBS로 세척하였다. 세척한 균체는 Homogenizer(WiseTis HG-15A, Witeg, Germany)로 분쇄한 후(27,000rpm x 2min, 1분 간격으로 총 5회) -80℃에 보관하며 면역원으로 사용하였다. 분쇄한 균체액의 단백량은 Bio-rad protein assay(Bio-rad, USA) 시약을 사용하여 정량하였다.

Balb/c Mouse 면역

P. larvae 면역원(400㎍ protein/50㎕)을 7주령의 암컷 BALB/c 마우스에 2주 간격으로 3회 피하로 접종하였다. 각각 사용된 adjuvant는 FA(Sigma-Aldrich, USA), Alum adjuvant(1.0% Aluminum Hydroxide Gel, Sigma-Aldrich, USA), AddaVax(Invivogen, USA)으로서, 면역원과 동량을 섞어 사용하였다. 최종면역 24시간 후 세포융합을 진행하여 특이항체를 분비하는 잡종세포를 선택하였다(제주대학교 동물실험윤리위원회, 승인번호:2017-0032).

Immunoglobulin isotype 확인 ELISA

각 adjuvand별로 각각 과면역시킨 BALB/c mice 혈청 중의 특이 항체가를 비교하기 위하여, 제 3차 면역 후 7일에 미정맥에서 채혈한 혈액과, cell fusion 직전 mice의 심장에서 채혈한 혈액을 원심분리하여 ELISA를 실시하였다. Isotype 별 항체가를 측정하기 위한 ELISA는 다음과 같이 실시하였다. 즉, P. larvae 분쇄항원이 흡착된 96 well micro ELISA plate에 희석된 혈청 혹은 배양 상층액을 가하여 반응시킨 후, 2차항체 접합체로는 horseradish peroxidase (HRP)가 표지된 goat, anti-mouse IgM(μ-chain Specific, Sigma- Aldrich, USA), goat, anti-mouse IgG(γ-chain specific, Sigma- Aldrich, USA) 및 goat, anti-mouse IgG(H+L)(kpl, USA)를 사용하여 Immunoglobulin isotype별의 항체가를 확인하였다. 발색제로는 2,2′-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS, Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였으며, 405nm(reference 492nm)에서 흡광도를 측정하였다.

단클론 항체의 Immunoglobulin isotype 검사

잡종세포의 배양 상층액을 취하여 전술한 ELISA 방법으로 분석하였다.

결 과

Stock Mab clones의 Isotype

각각 개별적으로 수행된 선행연구에서 작성된 유효클론 중, P. larvae flagella 항원으로 면역시켜 작성하였으며, 지속적으로 특이항체를 분비하는 4종 잡종세포의 단클론항체 isotype 발현양상을 Table 1에 정리하였다. 해당 클론들은 FA를 adjuvant로 사용한 P. larvae Flagella를 면역시켜 개발된 것들로서, 6회의 추가접종으로 인한 과면역에도 불구하고 isotype은 모두 IgM으로 확인되었다.

Isotype feature of Mab clones against purified flagella of P. larvae with Freund’s adjuvant

또한, P. larvae균체 파쇄 항원을 면역시켜 얻은 유효클론에 의하여 분비된 단클론항체의 isotype은 Table 2에 정리하였다. FA와 Alum은 각각 66%(2 clones) 및 25%(1 clones)의 IgG type의 발현율을 보인 것에 반해 AddaVax adjuvant로 접종한 경우에서 100%(5 clones) IgG로의 class switching을 보였다.

Isotype feature of previously cloned Mabs based on the adjuvants applied in immunization

Adjuvant에 따른 면역마우스 혈청 Immunoglobulin의 항체가 비교

동시에 동일한 용량의 항원(400 ㎍/mouse)을 동일한 연령의(7주령) BALB/c mice에 면역시키고 잡종세포 융합과정을 실시하여 adjuvant별의 면역강도와 IgM 및 IgG type별의 항체가를 비교하였다. 제 3차 면역 후 7일째에 미정맥을 통하여 채혈한 BALB/c mice혈중의 항체가에 비하여 최종면역 24시간후 즉, cell fusion 직전에 심장을 통하여 채혈한 혈중 항체가 및 IgG type의 항체가는 각 adjuvant 별로 주목할 만한 차이는 인정되지 않았다(모두 105 titer 이상). IgM type의 항체가의 증가는 2개 면역 시점 및 adjuvant별의 각 경우에 모두 감지되지 않았다(모두 103 titer 미만). 한편, Cell fusion 시점에서 AddaVax adjuvant로 접종한 마우스에서의 IgG type의 항체가는 다른 접종군에 비하여 다소 낮은 경향을 보였다(Fig. 1).

Fig. 1.

Serum titers of anti-P. larve antibodies in BALB/c mice at the time of 3rd (A) and final (B) immunization. Notable differences of titers were not shown among sera immunized with 3 kinds of adjuvants. While IgG type antibody titers were raised to higher than x 105, no antibody response was observed in IgM type antibodies (○: Freund’s adjuvant, □: Alum adjuvant, △: AddaVax).

Adjuvant별로 비교한 MAb의 Isotype

Adjuvant가 Ig isotype switching에 미치는 영향을 확인하고자, 동일한 조건으로 adjuvant별로 구분하여 면역시킨 후 얻어진 단클론항체의 isotype을 비교하였다(Table 3). FA를 adjuvnat로 사용한 MAb clone의 isotype은 IgG type과 IgM type 이 모두 발현되었으며 IgG type이 67%, IgM type이 33%로 나타났다. Alum adjuvant를 사용한 경우에도 IgG type과 IgM type의 MAb clone이 모두 발현되었으며, IgG type이 91%, IgM type이 9%로 나타났다. 한편, AddaVax을 Adjuvant로 사용하였을 경우에는 선행연구의 결과와 마찬가지로 잡종세포의 100%에서 Isotype switching이 완성된 IgG type의 항체를 분비하였다.

Isotype feature of MAbs according to the adjuvants used in production of hybridoma to P. larvae antigen

고 찰

꿀벌은 다양한 양봉산물을 생산할 뿐 아니라 식물의 수분활동을 주도하는 중요한 역할을 한다 [4, 11]. AFB는 꿀벌의 생육을 위협하는 중요한 감염병이다. 저자들은 미국부저병에 대한 면역학적 진단소재 개발을 위하여 P. larvae에 대한 Mab를 개발한 바 있다. 이 과정 중 흥미롭게도 IgM type의 단클론항체를 분비하는 잡종세포주가 다수 수립되었다 [8]. 비록 단클론항체의 각 isotype들은 분자적인 특성에 의하여 각각의 적합한 용도로 활용될 수 있을 것이나, 이러한 isotype의 결정은 연구자의 의도와는 상관없이 이루어진다.

Apiratmateekul 등 [1]은 Hemoglobin F에 대한 IgM type의 단클론항체를 얻기 위하여 IgM+ Spleen cell만을 따로 선별한 후 세포융합을 실시하여 IgM type의 단클론항체를 분비하는 잡종세포의 출현이 우세하도록 인위적인 처치를 한 결과를 보고하기도 하였다.

한편, Soukhtanloo 등 [14]이 chitinase에 대한 IgM type의 Mab에 대한 보고나, Lee 등 [10]이 Ebola virus glycoprotein이 encoding된 DNA 백신으로 얻어낸 IgM type의 MAb clone에 대한 보고는 immunoglobulin isotype switching의 완성여부가 개별 면역항원의 특성에 의하여 이루어짐을 시사하고 있다.

본 연구에서의 P. larvae 항원에 의한 유도되는 MAb에 관한 연구결과는 보고된 바가 많지 않기 때문에 [7, 8], immunoglobulin isotype switching을 불완전하게 유도하는 항원적인 특성에 관한 자료는 아직 알려져 있지 않다. 또한 면역보강을 위하여 혼합하여 사용되는 adjuvant의 적용에 따라 도출되는 결과의 차이를 살펴보는 것도 흥미로운 사항이다.

저자들은 P. larvae에 대한 Mab를 분비하는 잡종세포의 Isotype switching의 정도가 adjuvant에 따라 차이가 나는지 알아보고자, P. larvae균체항원을 3종의 adjuvant와 혼합하여 각각 BALB/c 마우스에 면역시킨 후, 세포융합에 의하여 제작된 잡종세포들이 분비하는 단클론항체의 isotype 생성을 비교하였다.

Isotype switching에는 CD40 signaling과 NF-κB의 활성을 필요로 하는데 [15] NF-κB의 활성화에는 MyD88이 영향을 주는 것으로 알려져 있다. Garg 등 [6]은 Salmonella Typhi Vi 항원으로 마우스를 면역시켰을 때, B cell에서 생성되는 immunoglobulin이 IgG로 isotype switching 되는 과정에 MyD88이 핵심적인 영향을 줌을 보고하였다.

이러한 관점에서 본다면, 본 연구에서 사용한 P. larvae 항원이 MyD88의 활성화에 지장을 주어 그 결과로 isotype switching이 완성되지 않은 IgM type의 clone이 다수 유도된 것으로 추론할수도 있을 것이며, 이에 대한 추가적인 연구가 수행되어야 할 것이다.

과면역을 실시한 3회의 면역 이후의 시점 및 B cell과 myeloma cell의 fusion 시점에서, 3종의 adjuvant로 면역시킨 각각의 마우스 모두에서는 이미 충분한 정도의 혈중 IgG 항체가의 상승을 보였다(x105<). 그러나 IgM 항체가는 확인되지 않았다(x103>), 이는 cell fusion 시점에서 이미 면역원에 대한 항체분비세포에서 isotype switching이 충분히 일어났기 때문이라고 추론할 수 있었다. 그럼에도 불구하고 단클론항체를 분비하는 잡종세포 중에는 IgM type의 Mab를 분비하는 clone도 다수 발현된 결과를 미루어 볼 때, 비장세포 중에는 IgM+ Spleen cell들이 여전히 상당한 정도로 존재하고 있음을 시사한다.

결론적으로, 혈중 항체가로 비교한 adjuvants 간의 면역증강효과는 총량적으로나 isotype별 즉, IgG 및 IgM의 개별적인 개별적인 항체가의 차이를 보이지 않았으나, 잡종세포가 분비하는 MAb의 isotype switching 양상은 뚜렷한 차이가 있었다. 즉, Freund’s adjuvant는 66.67% (11/33), Alum adjuvant는 91.25%(73/80)가 IgG type으로 나타났으며, AddaVax adjuvant는 100%(14/14) IgG type으로의 isotype switching을 유도하였다. 이러한 결과는, isotype switching이 불완전하게 유도되는 특성을 보이는 P. larvae 항원으로 면역시켰음에도 불구하고 특정한 adjuvant 즉, AddaVax와 같은 면역보강제를 적용한다면 isotype class switching을 유도하는 제반요인들을 보완해 줄 수 주고 있음을 시사한다.

Acknowledgements

본 연구는 농림축산식품부의 재원으로 농림수산식품기술기획평 가원의 첨단생산기술개발사업(112042-3, 115058-02, 115102-03 의 지원을 받아 수행되었으며, 저자 일동은 이에 감사하는 바입니다.

References

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16. Webster RG. The immune response to influenza virus III. Changes in the avidity and specificity of early IgM and IgG antibodies. Immunology 1968;14:39–52.

Article information Continued

Fig. 1.

Serum titers of anti-P. larve antibodies in BALB/c mice at the time of 3rd (A) and final (B) immunization. Notable differences of titers were not shown among sera immunized with 3 kinds of adjuvants. While IgG type antibody titers were raised to higher than x 105, no antibody response was observed in IgM type antibodies (○: Freund’s adjuvant, □: Alum adjuvant, △: AddaVax).

Table 1.

Isotype feature of Mab clones against purified flagella of P. larvae with Freund’s adjuvant

Immunogen Adjuvant Immunizing dose Clone Reaction with anti-mouse Ig
IgG (H+L) μ γ α
Purified flagella Freund’s adjuvant 15㎍ prot., 6 times AF01 + + - -
AF02 + + - -
AF03 + + - -
AF04 + + - -

Table 2.

Isotype feature of previously cloned Mabs based on the adjuvants applied in immunization

Immunogen Adjuvant Immunizing dose Clone Reaction with anti-mouse Ig
IgG (H+L) μ γ α
Whole cell1) Freund’s adjuvant 200㎍ prot., 3 times AF13 + - + -
AF14 + + - -
AF16 + - + -
Alum adjuvant 200㎍ prot., 4 times AF20 + + - -
AF21 + - + -
AF22 + + - -
AF23 + + - -
AddaVax™ 400㎍ prot., 3 times AF24 + - + -
AF25 + - + -
AF26 + - + -
AF27 + - + -
AF28 + - + -
1)

Disrupted & homogenized bacterial antigen.

Table 3.

Isotype feature of MAbs according to the adjuvants used in production of hybridoma to P. larvae antigen

Immunogen Adjuvant Immunizing dose Clone number Reaction with anti-mouse Ig
μ γ
Whole cell1) Freund’s adjuvant 400μg prot, 3 times 33 11 (33%) 22 (66%)
Alum adjuvant 80 7 (9%) 73 (91%)
AddaVax™ 14 0 (0%) 1 (100%)
1)

Disrupted & homogenized bacterial antigen.