Jeong, Lee, Gu, Lee, Lee, and Hyun: Effects of canine mesenchymal stem cells-derived exosomes in a mouse model of canine mammary tumor

Abstract

Canine mammary tumors account for ?30%; of all tumors in the female dogs and approximately 50%; of the tumors are malignant. Exosomes have been the focus of great interest, as they appear to be involved in numerous important cellular processes. In this study, we examined the anti-tumor effects of canine mesenchymal stem cells-derived exosomes (MSC-exosomes) in an experimental murine mammary tumor model using canine mammary carcinoma cells, REM134. The MSC-exosomes were injected tumor site and tail vein of REM134 xenografted mice. We found that tumor size of the MSC-exosomes-treated group decreased compared to those of the only tumor group in REM134-driven tumorigenic mouse model. In addition, the MSC-exosomes-treated tumor group showed meaningfully reduced expression levels of the MMP-3, IL-1β;, IL-6, and TNF-α; compared to those in the tumor group. Specifically, we confirmed that the expression level of the CD133, potent cancer stem cell (CSC) markers, decreased in the MSC-exosomes-treated tumor group compared to the tumor group. This study suggests that the MSC-exosomes exhibited anti-tumor effects through downregulating CSC-related markers in the canine mammary tumor murine model. Further study is needed in the future, and we are conducting research on the detailed anti-tumor mechanism of the MSC-exosomes.

서 론

1980년대에 ?1세대 바이오 의약품?으로 불리는 “재조합 단백질 의약품”이 출시되었다. 재조합 단백질 의약품 출시 이후 등장한 ?2세대 바이오 의약품?은 “단일클론항체” 제품군으로 바이오 의약 시장의 큰 성과를 이끌었다. 1세대, 2세대에 이어 ?차세대 바이오 의약품?으로 불리는 “세포치료제”, “유전자치료제” 등은 단백질 기반 제품들과는 달리 윤리적 문제, 기술적 문제 등 다양한 부분의 고려사항들과 함께 지속적으로 발전하고 있다.
이 중, 세포치료제에 쓰이는 세포의 종류는 크게 줄기세포와 면역세포, 피부세포, 연골세포 등으로 나뉜다. 분화의 관점에서 보면, 미분화된 세포(줄기세포)와 분화된 세포, 즉 체세포(면역세포?피부세포?연골세포 등)로 나눌 수 있다. 줄기세포는 배아줄기세포, 역분화줄기세포, 성체줄기세포로 나뉘며, 면역세포는 수지상세포, 자연살해세포, T세포 등으로 나뉜다. 2001년 ?콘드론(㈜세원셀론텍, Republic of Korea)?이 국내 최초 세포치료제로 품목허가를 받은 이후 2019년까지 총 16개의 제품이 세포치료제로 허가되었으며(2020.04 기준), 2017년 세계 최초 골관절염 유전자치료제인 ?인보사-케이주(㈜코오롱제약, Republic of Korea)?는 종양 유발 가능성에 대한 안전성 논란으로 식품의약품안전처로부터 2019년 품목허가가 취소되었다. 이처럼 유전자를 도입하는 과정에 있어 세포의 체내 종양 유발 가능성 등 안전성에 대한 우려가 사회적 논란이 되면서 현재 세포치료제 시장의 흐름도 변하고 있다.
최근 세포를 기초 연구나 임상에 직접 적용하는 연구 외에 “세포외소포(extracellular vesicles, EV)”를 이용한 연구들이 다양한 분야에서 추진되고 있다. 세포외소포는 세포에서 분비되는 이중 지질막 구조의 물질로 크기에 따라 엑소좀(exosomes, 40?200 nm), 미세소포(microvesicles, 200?1,000 nm), 대형 온코좀(large oncosomes, 1?10 μ; m)으로 나뉜다. 이 중, 엑소좀은 세포에서 분비되는 100 nm 전후 크기의 작은 소포로서, 세포의 성질과 상태를 대변하는 역할을 한다. 엑소좀은 mRNA와 miRNA 같은 핵산과 단백질 등을 포함하고 있고 세포는 이 엑소좀을 통해 특정 메시지를 분비하게 되며, 이 과정에서 세포 간 소통(cell-to-cell interaction)이 이루어진다. 또한, 엑소좀은 체내에 자연적으로 존재하고 융해되므로 다른 캐리어(나노 캐리어 등)에 비해 면역반응과 독성이 적고 목표할 지점으로 갈 확률이 높아서 뇌종양 치료 분야에서는 항암제를 효율적으로 전달하는 deliver의 역할을 하여 “새로운 치료 메신저”로서도 각광받고 있다 [15, 21, 25, 26]. 2018년 12월 식품의약품안전평가원에서는 ?세포외소포치료제 품질, 비임상 및 임상평가 가이드라인?을 제정하여 세포가 분비하는 세포외소포를 치료제로 개발할 경우 에 필요한 고려사항을 제시하였다 [32].
현재 국내 허가된 세포외소포치료제는 없으며, 국내 바이오기업들이 다양한 엑소좀 연구 및 이를 활용한 치료제 개발을 추진 중이다. 본 연구는 개 유선종양 세포주 REM134를 이용하여 면역부전 마우스에서 개 유선종양 동물모델을 만들고 개 지방조직 유래 성체줄기세포로부터 수집한 엑소좀을 적용하여 수의분야에서 유선종양을 포함한 고형암에 대한 cell-free 치료제로서 엑소좀의 가능성을 고찰하였다.

재료 및 방법

개 지방조직 유래 성체줄기세포 및 개 유선종양 세포주 배양

개의 복부 피하로부터 지방조직을 수집한 다음 300 U/mL penicillin (Gibco, USA)과 300 μ; g/mL streptomycin (Gibco, USA)이 포함된 dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS; Gibco, USA)으로 2회 세척하고 멸균 가위를 이용하여 조직을 잘게 자른 후, 0.1%; collagenase type Ι; (Gibco, USA)을 처리하여 37˚; C에서 40분간 반응시켰다. 100 μ; m cell strainer (BD Falcon, USA)로 조직 부유물을 거르고 1,500 rpm에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 원심 분리된 pellet에 10%; fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA), 100 U/mL penicillin, 100 μ; g/mL streptomycin이 포함된 low glucose dulbecco's modified eagle's medium (DMEM; Gibco, USA)을 넣고 잘 섞은 다음 175 T-flask에 세포를 분주하고 5%; CO2, 37˚; C의 세포배양기에서 배양하였다. 다음 날 배양액을 교체하고 2일 간격으로 배양액을 교체하였으며, 세포의 밀집도가 80%;에 도달하면 0.25%; Trypsin-EDTA (Gibco, USA)를 처리하여 다음 계대 배양하였다.
개 유선종양 세포주인 REM134 (ECACC, 12122002, UK)는 10%; FBS, 100 U/mL penicillin, 100 μ; g/mL streptomycin, 1× glutamax (Gibco, USA)가 포함된 DMEM을 사용하여 5%; CO2, 37˚; C의 세포배양기에서 배양하였다. 2일 간격으로 배양액을 교체하였으며, 세포의 밀집도가 80%;에 도달하면 0.25%; Trypsin-EDTA (Gibco, USA)를 처리하여 다음 계대로 배양하였다.

개 성체줄기세포의 세포 표면 특이 단백질 발현 및 중배엽 분화 유도

FACS Calibur™ flow cytometer (Becton Dickinson, USA)를 이용하여 개 지방조직 유래 성체줄기세포의 세포 표면 특이 단백질의 발현을 확인하였다. 0.25%; Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 탈착한 다음 DPBS로 2회 세척하였다. 5 × 105개의 세포에 형광물질이 결합된 mouse anti-dog CD34 (PE; 59369, BD Pharmingen, USA), mouse anti-dog CD44 (PE; MAB5549, R&D Systems, USA), rat anti-dog CD45 (FITC; MCA1042F, AbD serotec, UK), rat anti-dog CD90 (PE; 12-5900, eBioscience, USA) 항체를 넣고 1시간 동안 반응한 다음 DPBS로 2회 세척하여 Cell Quest Pro (Becton Dickinson, USA) 프로그램을 사용하여 결과를 분석하였다. 또한, 개 지방조직 유래 성체줄기세포의 중배엽 세포로의 분화 능력을 확인하고자 지방세포 및 골세포 분화를 위해 6-well plate에 well당 5 × 104개의 세포를 부착하여 세포의 밀집도가 80%; 이상 도달하도록 배양한 다음 맞춤 배지로 분화를 유도하였다. 연골세포 분화를 위해 24-well plate에 well 당 5 drop (5 × 104 cells/drop)을 형성하고 3?4시간 동안 군락(colony)을 형성한 다음 맞춤 배지로 분화를 유도하였다. 21일 후에 DPBS로 2회 세척한 다음, 4%; paraformaldehyde로 30분간 고정하고 분화 확인을 위한 염색용 시약(Adipogenic/Oil red O stain kit; Osteogenic/Alzarin Red stain kit; Chondrogenic/Alcian blue, IHC World, USA)을 이용하여 중배엽 세포로의 분화능을 확인하였다. 분화배지의 조성은 Table 1에 나타내었다.
Table 1.
Composition of differentiation media
Adipogenesis ? Osteogenesis ? Chondrogenesis ?
Dexamethasone (μM) 1 Dexamethasone (μM) 0.1 Dexamethasone (μM) 0.1
Indomethacin (μM) 100 L-ascorbic acid 2-phosphate (μM) 50 L-ascorbic acid 2-phosphate (μM) 0.1
3-Isobutyl-1-methylxanthine (mM) 0.5 β-glycerophosphate (mM) 10 TGF-β3 (ng/mL) 10
Insulin (μg/mL) 10 ? ? ? ?

정량적 중합효소연쇄반응(quantitative real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction, qRT-PCR)

개 성체줄기세포의 중배엽 분화 관련 유전자(lipoprotein lipase (LPL), Leptin, fatty acid binding protein 4 (FABP4), collagen type I alpha 1 (COL1A1), osteopontin (OP), osteonectin (ON), collagen type II alpha 1 (COL2A1), Aggrecan) 및 REM134 유래 악성종양 형성 관련 유전자(CD133, matrix metalloproteinase-3 (MMP-3), interleukin-1beta (IL-1β;), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α;))의 발현을 조사하고자 miRNeasy mini kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 세포 및 조직으로부터 total RNA를 추출하였다. Nano-drop 1000 (Thermo, USA)을 사용하여 RNA 상태와 농도를 측정한 다음, GoScriptTM Reverse Transcriptase (Promega, USA)로 cDNA를 합성하였다. qRT-PCR은 96-well plate에 LightCycler® 480 SYBR Green I Master Mix (Roche Diagnostics, USA)를 사용하여 pre-denaturation (95˚; C, 10분), annealing (60˚; C, 10초), elongation (72˚; C, 10초)을 1cycle로 지정하여 총 45 cycle을 반복하였다. Melting curve 분석은 internal control gene을 이용한 상대정량법(The comparative CT method)을 이용하였고 internal control gene으로 β;-actin 을 사용하였다. 사용된 primer의 정보와 조건은 Table 2에 나타내었다.
Table 2.
Primer sequences
Gene Primer sequence (5’-3’) Accession Number
CD133 F ?AGC CCT GTT GAA CGT GAA CA
R ?GTT GTA GCC ACT GGA GGG AC
KJ654317
MMP-3 F ?GTT GGA GGT GAC AGG GAA GG
R ?CCA GGG AAG GTG GTG AAG TC
AY183143
IL-1 β F ?GCC AAG ACC TGA ACC ACA GT
R ?TGA CAC GAA ATG CCT CAG AC
NM_001037971
IL-6 F ?CCT GGT GAT GGC TAC TGC TT
R ?TTG TTT GCA GAG GTG AGT GG
U12234
TNF-α F ?GAG CCG ACG TGC CAA TG
R ?CAA CCC ATC TGA CGG CAC TA
Z70046
β-actin F ?GCT ACG TCG CCC TGG ACT TC
R ?GCC CGT CGG GTA GTT CGT AG
NM_001003349

F, forward; R, reverse; MMP-3, matrix metalloproteinase-3; IL-1β, interleukin-1 beta; IL-6, interleukin-6; TNF-α, tumor necrosis factor-alpha.

개 성체줄기세포 유래 엑소좀 수집 및 특이마커 분석

개 지방조직 유래 성체줄기세포로부터 엑소좀을 분리하기 위해 175T-flask에 4 × 106개의 세포를 부착하여 1일간 배양하였다. 다음 날 1%; penicillin/streptomycin이 포함된 DPBS로 세척한 다음 exosome-depleted FBS (Gibco, USA)를 포함한 세포배양액으로 교체하여 3일간 배양하였다. 배양액을 50 mL tube 에 수집하여 연속적으로 원심 분리한 다음 0.22 μ;m filter로 상층액을 거르고 100 kDa 농축 filter tube (Millipore, USA)를 이용하여 배양액을 농축하였다. 초고속 원심 분리전용 tube에 농축액을 옮겨 담아 100,000 g에서 90분간 초고속 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 0.22 μ; m filter (Corning, USA)로 여과한 PBS를 넣어 튜브 바닥에 있는 침전물을 녹여준 뒤 새로운 tube에 옮겨 담아 냉동 보관하였다.
수집된 엑소좀은 bovine serum albumin을 기준으로 BCA kit (Thermo fisher, USA)를 이용하여 단백질을 정량하였다. 정량한 15 μ; g의 시료를 100˚; C에서 3분간 가열하고 4˚; C에서 안정화한 다음, 10%; sodium dodecyl sulfate poly-accrylamide gel 에서 전기영동하였다. 단백질을 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Millipore, USA)으로 옮긴 다음 0.1%; Tween-20이 혼합된 tris-buffered saline (TBS-T) 용액으로 희석한 5%; skim milk를 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다. Membrane을 TBS-T로 세척한 후 1차 항체 anti-CD63 (1:1000; Novus biologicals, USA), anti-CD81 (1:1000; Origene, USA)와 anti-HSP70 (1:1000; Invitrogen, USA)와 4˚; C에서 overnight한 다음, 2차 항체인 anti-mouse IgG (1:2000; Cell signaling technology, USA) 또는 anti-rabbit IgG (1:2000; Cell signaling technology, USA)를 상온에서 90분간 반응시키고 TBS-T로 세척하였다. Western blotting detection system을 이용하여 membrane에 부착된 단백질을 필름에 ECL (GE healthcare, UK)로 감광하였다.

면역부전 마우스를 이용한 유선종양 형성 및 모니터링

생후 5주령 암컷 BALB/c 누드 마우스(Charles river, USA)를 온도(22 ± 3˚; C), 습도(50 ± 5%;) 및 명암주기(12시간 낮, 12시간 밤)가 조절되는 표준 사육 환경의 무균 사육실에서 1주일 적응시켰다. 1 × 104개의 REM134를 DPBS (60 μ; L)에 부유하여 growth factor reduced matrigel (Corning, USA)과 1:1로 잘 섞은 다음 21G 주사기를 이용하여 오른쪽 유선 지방 지지체 부위의 피하에 투여하여 유선종양 형성을 유도하였다. 또한, 엑소좀의 항종양 효과를 확인하고자 유선종양 형성 유도 후 2주간 잠복기를 거치고 육안으로 형성된 종양을 확인한 다음, 1주일에 각 1회씩 종양 부위와 꼬리 정맥으로 100 μ; g의 엑소좀을 6주간 투여하였으며, 총 8주에 걸쳐 모니터링하였다. 종양의 크기는 caliper를 이용하여 1주일 간격으로 측정하였으며, 종양의 부피(V)는 다음 식을 사용하여 계산하였다.
V=;a×b×1/2?(mm3)∗;a;?(mm),?b;??(mm)

통계학적 분석

모든 실험은 독립적으로 3회(n=;3) 수행하였고 그 결과를 평균과 표준편차(mean ± SD)로 나타내었으며, 각 실험군의 평균값 비교는 one-way ANOVA (analysis of variance)와 Student's t-test (JMP ® 6.0; SAS Institute, USA)를 사용하여 분석하였다.
Fig. 1.
Isolation and characterization of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (cAD-MSCs) at passage 3 (P3). (A) Cell morphology showed a fibroblast-like shape (x 40, × 100), (B) Flow cytometry histograms show the expression of selected molecules (CD34, CD44, CD45, and CD90) in cAD-MSCs populations compared to the control, (C) Differentiation potential of cAD-MSCs. The cAD-MSCs were cultured in adipogenic, osteogenic, and chondrogenic medium for up to 21 days. Adipogenesis, osteogenesis, and chondrogenesis were demonstrated by Oil Red O, Alcian Blue, and Alizarin Red staining, respectively (adipogenesis; × 200, osteogenesis; × 100, chondrogenesis; x100), (D) Expression of differentiation markers (LPL, Leptin, FABP4, COL1A1, OP, ON, COL2A1, and Aggrecan) in adipogenesis, osteogenesis, and chondrogenesis by qRT-PCR. (∗; p<0.05, ∗;∗; p<0.01, ∗;∗;∗; p<0.001).
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Fig. 2.
Isolation and characterization of cAD-MSCs-derived exosomes. (A) The culture medium of cAD-MSCs with exosome-depleted fetal bovine serum was replaced, and the culture supernatant was harvested. The supernatant was centrifuged to remove cells and debris and then filtered using a 0.22 μ;m filter. The filtrate centrifuged at 100,000 g for 90 min at 4℃ using ultracentrifugation. (B) cAD-MSCs-derived exosomes contained amounts of protein determined bicinchoninic acid (BCA) assay with absorbance at 562 nm. Using western blotting, exosome markers (CD63, CD81, and HSP70) were identified in the samples.
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결 과

개 지방조직 유래 성체줄기세포 배양 및 특성 분석

개 지방조직으로부터 분리한 최초의 세포는 7일 내에 세포 군락을 형성하여 섬유아세포(fibroblast-like) 형상으로 부착하여 자라는 것을 확인하였다. 또한, 세포 표면 특이 단백질 발현을 확인하고자 유세포 분석을 수행한 결과, 개 지방조직으로부터 분리한 세포에서 CD44, CD90의 발현과 CD34, CD45는 발현하지 않음을 확인하였다. 다음으로 개 지방조직으로부터 분리한 세포의 중배엽세포로의 분화능을 확인한 결과, 분화된 지방세포 내에서 붉은 색으로 염색된 지방 축적이 확인되었고 분화된 골세포에서 칼슘 염색과 분화된 연골세포에서 염색된 연골 기질이 확인되었다. 또한, qRT-PCR을 수행하여 분화된 세포의 특이유전자 발현을 확인한 결과, 지방세포, 골세포, 연골세포로 분화된 세포에서 대조군과 비교하여 LPL, Leptin, FABP4, COL1A1, OP, ON, COL2A1, Aggrecan과 같은 특이유전자의 발현 증가를 관찰하여 개 지방조직으로부터 분리한 세포의 중배엽세포로의 분화능을 확인하였다.

개 성체줄기세포 유래 엑소좀 수집 및 특성 분석

개 지방조직 유래 성체줄기세포로부터 순도 높은 엑소좀 수집을 위해 순차적인 원심분리방법(serial centrifuging)을 통해 엑소좀을 수집하고 그 특성을 분석하였다. 그 결과, 개 지방조직 유래 성체줄기세포로부터 분리한 물질에서 엑소좀 특이 마커인 CD63, CD81, HSP70의 발현을 확인하여 분리된 물질을 엑소좀으로 판단하였다.

개 성체줄기세포 유래 엑소좀의 항종양 효과

암컷 BALB/c 누드 마우스에 REM134를 이용하여 개 유선종양 형성을 유도하였으며, 2주차에 개 지방조직 유래 성체줄기세포로부터 분리한 엑소좀을 종양 부위와 꼬리 정맥으로 투여하여 종양 형성능 및 종양 크기를 관찰하였다. 그 결과, 종양 형성을 유도한 실험군은 종양을 유발하지 않은 정상군에 비해 2주차 이후 육안상 서서히 종양 크기가 증가하였다. 또한, 종양 형성을 유도한 실험군과 종양 형성 2주차에 엑소좀을 투여한 실험군을 8주간 비교한 결과, 종양 형성을 유도한 실험군에 비해 2주차에 엑소좀을 투여한 실험군의 종양 크기는 50 ± 28.77%; 감소함을 확인하였다. 8주차에 마우스를 안락사하여 종양 조직을 수집한 다음, 종양 조직으로부터 악성종양과 관련한 유전자의 발현을 분석하였다. 그 결과, 종양의 형성, 유지, 전이 및 재발에 관여하는 대표적인 악성종양 형성 관련 유전자인 CD133과 MMP-3, IL-1β;, IL-6, TNF-α;의 발현이 유의적으로 감소함을 확인하였다.

고 찰

반려동물의 주요 사망원인인 암은 개나 고양이에서 흔히 발생한다. 2,000여건의 동물 부검결과에서 10살 이상 개의 약 45%;가 암으로 사망했고, 약 23%;는 나이와 상관없이 암으로 사망했다고 알려져 있다. 대표적인 반려동물인 개는 사람의 2배 정도의 종양 발생률을 나타내며, 사람보다 빠른 속도로 종양이 진행된다. 특히, 호발하는 악성종양 중 발생률이 높고 치료가 어렵다고 알려진 유선종양은 모든 포유류군에서 발생한다. 개 유선종양은 대표적인 악성종양으로서 사람과 유사한 발병 부위를 나타낼 뿐 만 아니라 분자학적, 조직학적, 형태학적 측면에서도 여성의 유방암과 유사성을 지니고 있어 유방암 연구분야의 실험모델로서도 활용되고 있다 [18, 20]. 개에서 암을 치료하는 방법으로는 주로 외과적 수술을 사용해왔다. 1946년에 백혈병 진단을 받은 개를 대상으로 화학적 치료가 시도되었고 [14], 이후 점차적으로 각종 암에 화학적 치료가 적용되기 시작하였으나 [3], 환축을 대상으로 장기간 치료를 지속하는 경우는 쉽지 않았고 이러한 화학적 치료의 효능을 뒷받침할 만한 수의학적 자료 부족의 한계가 있었다 [1]. 특히, 악성종양의 코어(core)가 되는 암줄기세포를 완전히 제거하지 못할 경우, 살아남은 암줄기세포는 다시 종양을 재생, 증식시키므로 종양의 진행, 재발 및 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 [13, 17, 24]. 현재 반려동물의 종양치료는 외과적 절제가 대부분이고 아직까지 기술할만한 치료법은 없다.
Fig. 3.
Effects of cAD-MSCs-derived exosomes on canine mammary tumorigenesis. (A) REM134 cells xenografted mammary fat fad of BALB/c nude mouse. After 2 weeks, cAD-MSCs-derived exosomes were injected tumor site and tail vein twice per week up to 8 weeks. At the end of experiment, we dissected tumor tissues from mammary fat pad. (B) We observed expression levels in tumorigenesis related markers from tumor tissues of control, tumor group (REM134), and cAD-MSCs-derived exosomes-treated tumor group (REM134 +; MSC-exosomes) by qRT-PCR. β;-actin was used as a housekeeping gene. Values are means ± SD of three individual experiments. (∗;∗;∗;p<0.001).
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미국 시장조사기관인 Grand View Research는 글로벌 엑소좀 시장은 연평균 18.8%; 성장하여 2030년에는 2.28억 달러 규모로 크게 성장할 것을 전망했고, BCC Research는 ?세계의 엑소좀 진단 및 치료 시장?에서 엑소좀 시장 및 관련 기술, 진단, 치료 등의 분석을 통해 글로벌 엑소좀 시장은 2018?2023년 48.4%;로 연평균 성장하여 2023년 1억 8천만 달러에 이를 것을 예상했다 [8, 9].
줄기세포 유래 엑소좀은 현재 다양한 연구에 적용되고 있다. 사람, 랫드, 마우스 유래 엑소좀을 심장 경색증(heart infarct)을 포함한 심장질환 동물모델(마우스, 랫드, 돼지 등)에 적용한 연구 결과가 보고되었고 [2, 23], 신부전(kidney injury)을 포함한 신장질환 동물모델에서의 연구 결과도 보고되었으며 [30], 이 외에도 뇌졸중(brain stroke), 간섬유증(liver fibrosis), 폐질환(lung hypoxia), 장염(intestine enterocolitis), 피부외상(skin wound) 등의 동물모델에서도 연구 결과가 보고되었다 [16, 22, 28, 29, 31]. El-Tookhy 등은 피부손상에 대한 줄기세포 유래 엑소좀의 상처 치유, 콜라겐 합성, 혈관 신생 등의 효과를 보고하였고 [7], Gabr 등은 개 척수손상에 대한 줄기세포 유래 엑소좀의 신경재생 효과 등을 보고하였으며 [11], Crain 등은 개 줄기세포 유래 엑소좀의 T세포 증식 저해 효과 등을 보고한 바 있다 [4].
수의분야에서 엑소좀을 이용한 종양 연구는 시작단계이다. 1982년 확립된 개 유선종양 세포주 REM134는 종양 형성 특성을 이용한 유선종양 관련 기초 연구에 꾸준히 활용되고 있는 세포주이다 [6]. 본 연구에서는 개 유선종양 세포주, REM134를 이용하여 누드 마우스에 유선종양 형성을 유도한 다음 개 성체줄기세포 유래 엑소좀의 항종양 효과에 대하여 조사하였다. 종양 형성을 유도한 실험군은 종양을 유발하지 않은 정상군에 비해 2주차 이후 종양 크기가 서서히 증가하였으며, 엑소좀을 투여한 실험군의 종양 크기는 50%; (± 28.77%;) 감소하였다. 또한, 마우스 종양 조직으로부터 악성종양과 관련된 유전자의 발현을 비교한 결과, 종양 형성, 유지, 전이 및 재발에 있어서 중요한 역할을 하는 암줄기세포 관련 대표적 유전자인 CD133의 발현이 현저하게 감소하였으며, 염증과 관련된 다양한 인자들, IL-1β;, IL-6, TNF-α; 및 MMP-3의 발현 또한 유의적으로 감소함을 확인할 수 있었다.
CD133은 암줄기세포를 구분하는 가장 대표적인 마커로, 2003년 Hemmati 등에 의해 CD133+; 세포를 면역부전 마우스에 투여하여 뇌종양을 효율적으로 증식시키는 연구가 수행되었다 [12]. 이 후 CD133은 다양한 고형암의 중요한 암줄기세포 마커로 알려졌으며, CD133+; 암줄기세포를 타겟팅하는 연구들이 진행되고 있다. Fakiruddin 등은 줄기세포에 세포고사를 조절하는 유전자인 TRAIL을 발현하고 CD133+; 암줄기세포를 타겟팅하여 폐암 연구에 적용을 시도하였고 [10], Yin 등은 RNA 나노 파티클로 CD133을 타겟팅하여 유방암 중에서도 생존율이 낮고 치료가 어려운 삼중복 음성 유방암 연구에 적용을 시도하였다 [27]. MMP-3는 암세포의 이동 및 침습을 돕는 MMPs family 로서 암의 전이와 관련되어 있다고 알려져 있다 [5]. 본 연구에서는 엑소좀을 투여한 실험군에서 CD133과 더불어 MMP-3의 발현 또한 유의적으로 감소함을 확인하였다.
HER-2는 사람 유방암의 중요한 유전자로 유방암 환자의 20%; 이상에서 증폭이 확인되므로 HER-2를 타겟으로 하는 항체치료제들이 개발되고 있지만, HER-2를 overexpressing하는 유방암 환자의 경우에도 대략 25%; 정도만 효과를 나타낸다. 본 연구에서 REM134를 이용하여 누드 마우스에 유선종양 형성을 한 경우 HER-2 유전자의 유의적 변화는 확인되지 않았다. 또한, 사람 유방암의 경우 VEGF를 통한 혈관 형성 및 영양 전달 신호가 중요하다. Pakravan 등은 사람 유방암 세포주에서 줄기세포 유래 엑소좀을 이용하여 mTOR/HIF-1α;/VEGF 신호 조절을 통해 유방암 세포주의 angiogenesis 억제 효과를 보고하였다 [19]. 그러나, 본 연구에서는 VEGF 유전자의 유의적 변화는 확인되지 않았으며 대신 대표적인 염증성 인자인 IL-1β;, IL-6, TNF-α;의 발현이 유의적으로 감소함을 확인할 수 있었다.
본 연구는 개 유선종양 세포주 REM134를 이용하여 누드 마우스에 개 유선종양을 형성하고 줄기세포 유래 엑소좀을 투여하여 항종양 효과를 연구한 최초의 보고로 아직 자세한 기전에 대한 연구는 남아있으며, 수의분야에서 종양 연구를 위한 cell-free 치료제로서 개 지방조직 유래 성체줄기세포로부터 수집한 엑소좀의 가능성을 확인하였다.

감사의 글

본 연구는 농림축산검역본부 연구사업(과제번호: B-1543083-2018-20-01)의 지원으로 수행되었으며, 이에 감사드립니다.

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